La última edición de la clase xiaoao habló con todos."Edición práctica del desarrollo de la metodología Elisa - Desarrollo de métodos cuantitativos para la detección de biomoléculas".
Este número de Xiao ao comparte con ustedes otro tema importante: "desarrollo de la metodología Elisa versión práctica - Desarrollo de métodos de determinación de afinidad".

I. Prólogo

En la actualidad, los métodos utilizados para determinar la afinidad entre los ligandos receptores, es decir, la constante de equilibrio de disociación, son principalmente:

1. Método de determinación termodinámica
2. Método de determinación dinámica
3. Método de concentración saturada

Entre ellos, el método de determinación dinámica y el método de concentración saturada son más comunes:Método de determinación dinámica(por ejemplo, biacare)Implica una inversión de instrumentos relativamente cara,El método de determinación de la concentración saturada es un método de determinación común en la gran mayoría de las empresas biofarmacéuticas nacionales.

La determinación de la afinidad por Elisa es el modelo principal del método de determinación de la concentración saturada, que se utiliza comúnmente para la evaluación de la actividad de las proteínas antigénicas o los niveles de proteínas de los anticuerpos y la evaluación de la estabilidad de los anticuerpos.
Los kits de ELISA para la determinación de la afinidad a menudo no están comercializados y requieren el desarrollo metodológico de experimentadores.

Debido a la falta de educación en biotecnología y la acumulación insuficiente de empresas de investigación y desarrollo de nuevos medicamentos en esta aplicación, un método de determinación de la afinidad por Elisa que puede ser verificado por la metodología es algo difícil para muchos profesionales, y es probable que haya falacias como errores o desviaciones en la transmisión de nuevos números.
Una de las falacias es el desarrollo de un método de determinación de la afinidad por Elisa utilizando condiciones experimentales cuantitativas de elisa.

Este artículo comienza con los principios básicos del método de determinación de la afinidad.Describe los principios básicos de la determinación de la afinidad por el método de concentración saturada, describe la relación de dosis de anticuerpos antigénicos durante el desarrollo del método Elisa y varios errores que pueden ocurrir cuando el método Elisa se utiliza para la aplicación del método de determinación de la afinidad, y presenta un plan general de determinación de la afinidad y un Plan de desarrollo metodológico preliminar.

II. conceptos básicos de afinidad

Al analizar varios casos de reacciones químicas, explicamos a todos lo que es afinidad.

例子A
El hidrógeno y el oxígeno generan agua en condiciones de encendido.
Cuando la reacción se detiene, si la concentración molecular de hidrógeno en el ambiente de reacción es exactamente el doble de la concentración molecular de oxígeno, ambos se consumen, y solo hay agua en el ambiente de reacción; Si la concentración molecular de hidrógeno es mayor que el doble de la concentración molecular de oxígeno, el oxígeno se consume, y solo hay hidrógeno y agua en el ambiente de reacción; Cuando la concentración molecular de hidrógeno es inferior al doble de la concentración molecular de oxígeno, el hidrógeno se consume y solo hay oxígeno y agua en el ambiente de reacción.
Este es el conocimiento básico de las reacciones químicas, el resultado de las reacciones químicas, los reactivos pueden convertirse en productos, es decir, las reacciones pueden llevarse a cabo hasta el final, las reacciones con las características del proceso y el resultado de tales reacciones se llaman reacciones irreversibles.

例子B
Antígeno pd1(CD279)Y anticuerpos pd1(como PEmbrolizumab)Reacciona a temperatura y presión normales.
Cuando la reacción se detiene, si la concentración molecular de cd279 en el entorno de reacción es de 200 nm y la concentración molecular de pembrolizumab es de 100 nm, la concentración del complejo pembrolizumab - cd279 en condiciones ideales es de 97,86 nm, la concentración molecular de cd279 es de 4,28 nm y la concentración molecular de pembrolizumab es de 2,14 nm;
Si la concentración mole de cd279 en el ambiente de reacción es de 100 nm y la concentración mole de pembrolizumab es de 200 nm, la concentración del complejo pembrolizumab - cd279 en condiciones ideales es de 49,81 nm, la concentración mole de cd279 es de 0,38 nm y la concentración mole de pembrolizumab es de 159,19 nm.

EJEMPLO C
Antígeno pd1(CD279)Antígeno pdl1(CD274)Reacciona a temperatura y presión normales.
Si la concentración molecular de cd279 en el entorno de reacción es de 200 nm y la concentración molecular de cd274 es de 100 nm, la concentración del complejo cd274 - cd279 en las condiciones ideales en el momento de la finalización de la reacción es de 2,35 nm, la concentración molecular de cd279 es de 197,65 nm y la concentración molecular de cd274 Es de 97,65 nm;
Si la concentración molecular de cd279 en el entorno de reacción es de 100 nm y la concentración molecular de cd274 es de 200 nm, la concentración del complejo cd274 - cd279 en las condiciones ideales en el momento de la finalización de la reacción es de 2,35 nm, la concentración molecular de cd279 es de 97,65 nm, la concentración molecular de cd274 es de 197,65 nm, y la gran mayoría de cd279 y cd274 no participan en la reacción.
Casos B y c, tanto antígenos como anticuerpos(ligandos y receptores)En combinación con la reacción, las dos reacciones tienen un proceso de reacción positiva para generar complejos, así como un proceso de reacción inversa para generar antígenos y anticuerpos por la reacción de disociación de complejos. el resultado final es el Estado de coexistencia de antígenos, anticuerpos y complejos de antígenos y anticuerpos.

Tal reacción se llamaReacción reversible.
Cuando las tasas de reacción positiva e inversa son iguales en una reacción reversible, la concentración de antígenos, la concentración de anticuerpos y la concentración de complejos de antígenos - anticuerpos en el sistema de reacción ya no aumentan ni disminuyen, la reacción reversible se completa y la concentración mole de cada componente en el sistema de reacción está en equilibrio dinámico.

Afinidad(Afinidad)Es el parámetro característico del Estado relativo entre antígenos, anticuerpos y complejos de antígenos - anticuerpos durante la reacción reversible, y su nombre más profesional y técnico es la constante de equilibrio de disociación kd, unidad MOL / L.(en línea con la unidad de concentración).

Cuanto menor sea el valor de afinidad, mayor será la afinidad, y la fuerza de afinidad determina el número relativo de componentes de la reacción reversible cuando se complete la reacción.

Por ejemplo, los ejemplos B y c son los mismos que 200nmcd279.(PD1)Respuesta, anticuerpos pembrolizumab(anticuerpos pd1)La afinidad con respecto a cd279 es de 0,4 nm, y el ligando cd274(PDL1)Con una afinidad de 8.200 nm frente al cd279, el complejo pembrolizumab - cd279 generado por la reacción final es de 97,86 nm, mientras que el complejo cd274 - cd279 es de solo 2,35 nm, una diferencia de 42 veces entre los dos.

A diferencia de las reacciones irreversibles, además de la concentración molecular de anticuerpos antigénicos, antígenos y anticuerpos(ligandos y receptores)La afinidad entre ambos * afectará la cantidad de productos generados en la reacción reversible.

¿3. ¿ conoce los principios básicos del desarrollo metodológico de elisa?

Para una visión general de los métodos y principios de determinación de la afinidad, los lectores pueden referirse al artículo de evaluación de la afinidad de la tecnología de selección y evaluación de la biofuncionalidad.
Este artículo resume principalmente el método de concentración de saturación.
RrepresentarReceptoresoAntígenos,LrepresentarLigandosoAnticuerpos.
Utilizando el método de concentración saturada, si se quiere determinar la afinidad del Ligando con respecto al receptor, en presencia de una pequeña cantidad de r, se diluye el gradiente L para detectar la concentración del complejo R - l, y cuando la concentración del complejo R - l Representa la mitad de la concentración total de r, el valor de concentración correspondiente a l(EC50)Es decir, el valor KD de l con respecto a R.
El complejo RL / R es decir, el valor B se puede reemplazar por el valor de la señal detectada, y la relación funcional entre la l diluida por gradiente y la señal cumple con la siguiente fórmula, y solo en estas condiciones experimentales específicas el valor EC50 puede ser equivalente al valor kd.
Hay varios puntos clave en la determinación del valor KD por el método de concentración de saturación.Es decir, las dos moléculas que interactúan, R debe ser pequeño y L debe diluirse continuamente en gradiente, y el valor de respuesta de la señal que debe obtenerse.(todos los sitios de Unión de R están ocupados por l)Es decir, el período de plataforma, entonces en esta condición, cuando se ocupa de la mitad de r, la concentración de l necesaria(EC50)Es el valor kd.
El método de concentración saturada determina principalmente los valores de señal que representan el complejo rl. el método de determinación puede ser la citología de flujo, el marcador isotópico, la polarización fluorescente o elisa.

IV. desarrollo de métodos comunes para la metodología Elisa para la determinación de la afinidad

Diseño

Proceso operativo general

01Preparación de la placa estándar de la enzima: tomar una concentración de 100 ug / ml de antígeno, disolverlo a temperatura ambiente, mezclar y diluir la solución de recubrimiento a 0,2ug / ml, 0,5ug / ml, 1ug / ml, añadir 100 ul / agujero de acuerdo con la tabla de distribución de muestra, añadir la placa estándar de la enzima por separado.(Nota 1)Entre ellos, se añade el líquido de recubrimiento como control de los anticuerpos de recubrimiento, y se pasa la noche a 2 - 8 ° c;
02Lavar la placa con detergente 3 veces, secar y agregar 300ul / líquido de cierre del agujero(Nota 2)La temperatura ambiente está cerrada durante 1 hora; Lavar la placa con detergente tres veces y secarla para su uso;
03Diluir el anticuerpo en un gradiente inicial de 3 veces de 100.000 ng / ml de acuerdo con el diseño(Nota 3)De acuerdo con el diseño, 100 ul / agujero se agregan a la placa microporosa;
04PonerOsciladores de microporos ohouse (ISLDMPHDG)En el interior, se establece una oscilación de 37 ° C y 600rpm durante 1 hora;

05Lavar la placa con detergente tres veces y secarla;
06Los anticuerpos vinculados a la enzima se diluyen a la concentración adecuada(Nota 4), enPergamino de ohouse(VXMNFS)arribaMezclar bien, 100 ul / agujero;

07Coloque en el Oscilador de placa microporosa y establezca una oscilación de 37 ° C y 600rpm durante 1 hora;
08Lavar la placa con detergente 4 veces y secarla;
09Tome el líquido de color correspondiente al anticuerpo enzimático, saque el equilibrio a temperatura ambiente 20 minutos antes de usarlo y mezcle bien en el batidor de remolino;
10Añadir líquido de color a 100 ul / agujero con 8 pistolas de drenaje;
11La solución de color se coloca a temperatura ambiente para evitar la luz durante 10 - 30 minutos.(Nota 5)V;
12Usar 8 pistolas de drenaje para agregar 100 ul / agujero al líquido de terminación para detener la reacción(este paso puede no ser necesario dependiendo del sustrato)V;
13Determinación del valor de la señal con un medidor de enzima(Nota 6)V;
14Análisis de los resultados(Nota 7).

íntima pequeña nota

Nota 1:Si es necesario reducir las altas concentraciones de anticuerpos durante la respuesta(100.000 ng/ml)La adsorción no específica de la placa estándar de la enzima, durante el proceso de encapsulamiento, se recomienda seleccionar la placa estándar de la enzima hidrofóbica.(poliestireno)La concentración de antígenos del sobre requiere una pequeña cantidad de 0,2 - 1ug / ml, y la situación específica debe juzgarse y optimizarse de acuerdo con el tamaño de la afinidad de los anticuerpos antigénicos. En términos generales, cuanto mayor sea la afinidad, menor será la concentración de paquetes de antígenos necesarios.
Nota 2:El líquido de cierre no necesariamente puede desempeñar un efecto de cierre, necesita ser verificado experimentalmente.(grupos sin antígenos envueltos)En términos generales, cuanto menor sea el peso molecular, mejor será el efecto del bloqueo.
Nota 3:En la etapa inicial del desarrollo metodológico, se puede ampliar el rango de concentración de la curva estándar en 100.000 ng / ml - 0,1 ng / ML para obtener una curva completa con un período de plataforma superior e inferior obvio. cuando la afinidad entre antígenos y anticuerpos es fuerte, la concentración de gradiente se puede reducir y el múltiplo de dilución se puede reducir al doble durante el proceso de optimización metodológica.
Nota 4:El efecto de los anticuerpos vinculados a la enzima es excesivo, la dilución de los anticuerpos vinculados a la enzima requiere una selección comparativa de diluciones diferentes, para los anticuerpos vinculados a la enzima del componente anticuerpo monoclonal, si los anticuerpos vinculados a la enzima con dos diluciones altas y bajas pueden producir la misma curva de dosis, lo que indica que los anticuerpos vinculados a la enzima son excesivos y la transmisión de señal de Elisa no produce desviaciones.
Para los anticuerpos vinculados a la enzima de los componentes multirresistentes, el juicio de su dilución es más complejo, y la concentración molecular de los anticuerpos vinculados a la enzima puede calcularse ligeramente por encima de cinco veces la concentración molecular del antígeno en el SOBRE. Cuando la concentración de anticuerpos vinculados a la enzima es pequeña, los anticuerpos vinculados a la enzima se atrapan en altas dosis de diferentes concentraciones de anticuerpos, y la curva tiene una plataforma falsa.
Nota 5:Para los sustratos de valor de absorción y los sustratos fluorescentes, el valor de señal detectado por el instrumento es proporcional al tiempo de desarrollo del color, y es apropiado controlarlo en 10 - 30 minutos. Es necesario confirmar con antelación el rango lineal de la señal del instrumento de detección, por ejemplo, si el rango lineal de la señal del valor de absorción del medidor estándar enzimático general es de 0 - 3 y el valor de absorción es no lineal entre 3 - 4, el valor de la señal debe controlarse para no exceder de 3 al desarrollar El color, y cuando el valor de la señal excede el rango lineal, la curva tiene una plataforma falsa.
Nota 6:Diferentes sustratos requieren diferentes instrumentos para la detección, la lectura de absorción, la lectura de fluorescencia y la lectura de quimioluminiscencia. Durante la selección del sustrato, preste atención a si el medidor de enzima del laboratorio tiene este tipo de función de lectura.
Nota 7:El ajuste estándar de la curva de dosis generalmente se ajusta con cuatro parámetros, lo que requiere un período de plataforma superior e inferior obvio.(valores a, d)La pendiente es generalmente de 0,8 - 1,2(valor b)Entre, EC50（Valor c)Es decir, el valor de afinidad del anticuerpo con el antígeno.

V. Resumen

De acuerdo con el método de concentración de saturación, cuando se utiliza Elisa para la determinación de afinidad, se necesita una curva s obvia de cuatro parámetros, es decir, una curva de señal que cambie gradualmente con la concentración de anticuerpos.
Hay un período de plataforma superior e inferior obvio a bajas y altas concentraciones de anticuerpos, y la mitad del valor de señal del período de plataforma superior corresponde a la concentración de anticuerpos.(EC50)El valor es el valor KD de afinidad entre antígenos y anticuerpos.
Debido a que el rango lineal de la señal de detección del instrumento es limitado, cuando la señal excede el rango lineal, la curva entrará en el período de plataforma falsa, lo que hará que la afinidad medida sea inexacta.
La concentración del antígeno envuelto determina directamente el valor de señal de la señal,Por lo tanto, al utilizar Elisa para la determinación de la afinidad, la concentración de antígenos del sobre debe ser lo más pequeña posible para obtener el valor de señal adecuado; Las concentraciones demasiado bajas de anticuerpos vinculados a enzimas también pueden hacer que la curva entre en un período de plataforma falsa.

Durante el desarrollo de la metodología elisa, la transmisión lineal de la señal por exceso de anticuerpos vinculados a la enzima debe ser verificada experimentalmente.
Cuando la señal no puede obtener un período de plataforma superior efectivo, significa que la afinidad entre los anticuerpos antigénicos es demasiado débil o que el paquete está demasiado envuelto en antígenos, y se necesitan mayores concentraciones de anticuerpos para que todos los antígenos se agarren para alcanzar el período de plataforma.
Limitado por las limitaciones de la sensibilidad de elisa, la afinidad es débil en algunos(>100 nM)Entre los antígenos de anticuerpos, el método Elisa básicamente no puede obtener un período de plataforma efectivo y un valor de afinidad que no se puede medir.
Cuando Elisa realiza pruebas de afinidad para evaluar la actividad del antígeno o medir la actividad del anticuerpo, el EC50 obtenido no es lo más pequeño posible, y la señal entra en el período de plataforma falsa.(alcanzar el límite de detección del instrumento, la concentración de unión enzimática es pequeña)Ambos hacen que el EC50 sea más pequeño, obteniendo así datos erróneos de afinidad, que también es una falacia que se produce fácilmente cuando el Elisa realiza la determinación de afinidad.
Hoy en día, muchos proveedores de proteínas antigénicas tienen tales falacias en la evaluación de la actividad antigénica.

La afinidad entre antígenos y anticuerpos está determinada por la estructura y la interacción de los dos,Puede ser 0,1 nms, 1 nms o 1000 nms. la evaluación de la calidad del método de determinación de afinidad Elisa depende de si este valor EC50 coincide con el valor de afinidad, que se puede verificar a través de métodos termodinámicos, métodos cinéticos y métodos de flujo celular en el método de concentración saturada.
Por el contrario, cuando un método Elisa no existe, como la señal entra en el período de plataforma falsa(alcanzar el límite de detección del instrumento, la concentración de unión enzimática es pequeña)Cuando se espera una falacia, su valor EC50 puede ser el valor real de la afinidad de respuesta.

El desarrollo metodológico con Elisa requiere un propósito claro de aplicación, cuantificación macromolecular y determinación de afinidad.
Diferentes propósitos de aplicación, las concentraciones de dosis relativas de antígenos y anticuerpos varían mucho, con diferentes curvas de dosis,Los lectores pueden comparar y aclarar las diferencias en combinación con el artículo anterior "edición práctica del desarrollo de la metodología Elisa - Desarrollo de métodos cuantitativos para la detección de biomacromoléculas".

¡Aquí está el intercambio de este número, ¡ nos reuniremos en el próximo período!

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