La temporada escolar ha vuelto.Experimento WangVoy a "mover ladrillos" de nuevo.
cómoExcelenteElegante Movimiento de ladrillostodavíaNo hay necesidad de pedir ayudaHermanos y hermanas

Por supuesto que sí.atención"Clase xiaoao"secciónYa.

Hoy Xiao ao les presentó
Es un artículoLos productos secos están llenos.de
Manual de práctica de métodos de exhibición de bacteriófagos
"Amplificación y cuantificación de bacteriófagos"

Esta es una rara nota de xueba.
¡Por favor, guarde (la colección)!

Parte 1

Hybridoma、Clonación unicelularyTecnología de visualización de bacteriófagosSon las tres tecnologías convencionales para el descubrimiento de anticuerpos, de las cualesTecnología de visualización de bacteriófagosComoTecnología en el nivel del Premio Nobel, que desempeña un papel muy importante en el proceso de investigación y desarrollo de medicamentos bioinnovadores,* ha acelerado el proceso de investigación y desarrollo de medicamentos anticuerpos.Tecnología de visualización de bacteriófagosNo solo desempeña un papel central en el proceso de descubrimiento y optimización de nuevos anticuerpos y polipéptidos, sino que también se puede combinar con la tecnología inmunológica animal tradicional para conectarse eficazmente con nanoanticuerpos y plataformas de descubrimiento de ratones transgénicos de origen humano completo.Puede ser ampliamente utilizado en anticuerpos, medicamentos de acoplamiento de anticuerpos y car - T / tcr - T y otros campos..Este artículo discutirá y compartirá los detalles de los experimentos de proliferación y amplificación de bacteriófagos de la tecnología de exhibición de bacteriófagos, guiará el proceso experimental con sus principios como base, y aumentará la tasa de éxito de la tecnología de exhibición de bacteriófagos en el proceso de descubrimiento de anticuerpos con el proceso experimental de excelencia.

Parte 2

- - Biblioteca de bacteriófagos
Fundamentos de la amplificación y la exhibición

El sistema comúnmente utilizado de bacteriófagos para mostrar fragmentos de anticuerpos se llama"Sistema 3 + 3"(3 es la proteína capsídica P3 del bacteriófago)V;3 + 3Representa que la proteína capsídica P3 tiene dos fuentes:

• Phagemid (phagemid)
• Bacteriófago asistido por m13ko7 (helper phage)

Granos de hongosLa proteína P3 en (phagemid) fusiona los genes de los fragmentos de anticuerpos y es clave para la diversidad de la biblioteca;Bacteriófagos auxiliaresLa proteína P3 en (helper phage) es la proteína P3 natural del bacteriófago.
* Los fagocitos son un vector plasmídico relativamente pequeño, que tiene una alta eficiencia de transformación en los Estados receptivos de E. coli y puede expandirse en E. coli.

Una vez infectado por un Bacteriófago auxiliar (helper phage), el Escherichia Coli que contiene el Bacteriófago se amplifica utilizando el sistema enzimático, las materias primas y la energía del Escherichia coli, y el Bacteriófago que contiene el Bacteriófago final se libera del Escherichia coli, y la proteína capsídica P3 del Bacteriófago de esta descendencia muestra fragmentos de anticuerpos.

Parte 3

- - en el proceso de amplificación de bacteriófagos
Dificultades encontradas y soluciones correspondientes

El proceso de construcción de la Biblioteca del Bacteriófago es en realidad el proceso de transmisión de la diversidad genética de los fragmentos de anticuerpos:
El proceso de transmisión de la diversidad de genes de anticuerpos en muestras de sangre a los fagocitos es el contenido de la construcción de la Biblioteca de fagocitos;
La transmisión de la diversidad de bacteriófagos a la diversidad de Escherichia Coli que contiene bacteriófagos es el contenido de la electrotransferencia de plasmídeos de bacteriófagos a Escherichia coli;
La transmisión de la diversidad de Escherichia Coli que contiene bacteriófagos a la diversidad de bacteriófagos es el contenido de la amplificación de bacteriófagos y también es una preocupación de la experiencia experimental de este artículo.

El objetivo final de la amplificación del Bacteriófago es convertir el gen del fragmento de anticuerpos de una sola copia en el Bacteriófago en 10 - 100 copias a través del proceso de amplificación del bacteriófago.Y estos genes de copia pueden mostrar fragmentos de proteínas de anticuerpos en la proteína P3 en la superficie del bacteriófago.

Para que el proceso de amplificación de los bacteriófagos permita mantener y transmitir la diversidad de la biblioteca, es necesario determinar el número y el volumen de Escherichia Coli que contiene bacteriófagos durante el proceso de amplificación en función del tamaño inicial de la biblioteca, el número de infecciones efectivas correspondientes a los bacteriófagos auxiliares añadidos y el número de bacteriófagos que contienen bacteriófagos añadidos después de la amplificación para la selección, que deben calcularse y evaluarse uno por uno.Las bibliotecas de bacteriófagos de diferentes tamaños de biblioteca requieren diferentes volúmenes de amplificación durante el proceso de amplificación.Es muy probable que un programa experimental solidificado provoque la pérdida de diversidad de la biblioteca.
Para aclarar estos problemas, primero debemos tener los siguientes conocimientos previos básicos:

() 👇 ¡¡ todos los siguientes contenidos se centran!!! (...)

1. Lectura de E. coli tg1 en od600: la concentración de bacterias representada por 1od es de 1e9 / ML.
2. Los bacteriófagos / bacteriófagos auxiliares tienen una mejor eficiencia de infección cuando tg1 está en la generación logarítmica * y el valor od600 de tg1 en la generación logarítmica * es de 0,4 - 0,8.
3. La tasa de crecimiento de tg1 en la generación de 20 minutos * requiere prestar mucha atención al crecimiento de tg1 y tomar bacterias a tiempo para experimentos.4. La relación entre el Bacteriófago Auxiliar y el tg1, moi, puede garantizar que todos los tg1 estén infectados a las 20: 1.
5. Los bacteriófagos que contienen bacteriófagos son capaces de infectar E. coli tg1 normal y dejar los bacteriófagos en tg1 y amplificarlos con la expansión de tg1, sin la expansión de bacteriófagos auxiliares.
6.Los plásmidos de los bacteriófagos contienen * resistencia, y los bacteriófagos auxiliares contienen * resistencia.
7. Los bacteriófagos que contienen bacteriófagos se pueden determinar mediante la infección por tg1 normal, dilución gradiente y aplicación de placas de Agar resistentes.8.Los bacteriófagos que contienen fagocitos en el modo 3 + 3 muestran una eficiencia relativamente baja de la proteína del fragmento de anticuerpos de fusión p3, solo entre el 5% y el 10%, y en el momento de la búsqueda, el título del Bacteriófago añadido debe ser más de 100 veces mayor que la diversidad de la biblioteca.
Otra cuestión más crítica esLos bacteriófagos, como virus, se propagan fácilmente en forma de aerosoles al aire para contaminar el entorno del laboratorio, infectándose así con E. coli con factor f positivo.(me duele la vida, arriesgo mi vida para mover ladrillos! "
EnExperimentos relacionados con la exhibición de bacteriófagosEs necesario hacerlo en un laboratorio relativamente cerrado.Para evitar la contaminación de los bacteriófagos por E. coli,Especialmente cuando se cultiva E. coli tg1 normal. La forma de inactivación de los bacteriófagos suele ser la exposición ultravioleta durante más de media hora.
¡(wang, una criatura calificada, ¡ es un asesino de virus que no tiene sentimientos!

Parte 4

- - expansión de bacteriófagosAumento y cuantificación
Compartir procesos experimentales específicos

El siguiente es un esquema experimental para ampliar una biblioteca de bacteriófagos del tamaño de una biblioteca 1e9.
* Si la biblioteca es demasiado grande o demasiado pequeña, se puede aumentar o disminuir el volumen de expansión proporcionalmente.

Día 1
(un día Calvo moviendo ladrillos)

1. Tomar 1 ml de CEPA tg1 (el número de bacterias es 1e10) que contiene gránulos bacteriófagos y añadir 250 ml de matraz agitador que contiene 100 ml de medio de cultivo 2xyt - ga,usarSacudidora de ohouseSacudida de bacterias de 220rpm a 37 grados a od600 es de aproximadamente 0,5.2. Tomar 20 ml de líquido bacteriano con un od600 de aproximadamente 0,5 (el número de bacterias es 1e10), infectarse de acuerdo con el Bacteriófago auxiliar M13 k07 con un Moi de 20: 1 y un pfu de 2e11, oscilando a 37 grados 220rpm durante media hora.3. Después de tomar la infección, el líquido bacteriano se utiliza en un tubo centrífuga de 50 ML.Centrifugadora ohouse 5816rCentrifugación 3200g durante 10 minutosEliminar el medio de cultivo para eliminar la glucosa del medio de cultivo inhibe la expresión de la proteína del fragmento de anticuerpos por fusión de la proteína P3 en los fagocitos.4. Suspensión pesada de bacterias con medio de cultivo 2xyt - ak, agregue el medio de cultivo a 400 ml y agite las bacterias durante la noche a 30 grados y 220rpm con un agitador 1l.

Día 2
(al día siguiente de mover ladrillos calvos)

5.Dividir 400 ml de líquido bacteriano por igual en botellas centrifugadoras grandes,usarCentrifugadora ohouse 5816r 10.000 G centrifugación durante 10 minutos, quitar la limpieza superior, 10.000 g centrifugar de nuevo durante 10 minutos,Eliminar los fragmentos residuales de hongos.6. Añadir 90 ml de solución de Peg a 400 ml de sobrenadante, incubar a 4 ° C durante 1 hora y acompañar una oscilación suave, y luegoCon función de control de baja temperaturaCentrifugadora ohouse 5816r Centrifugación de 4 ℃ 10000g durante 1 hora.7. Eliminar el sobrenadante y volver a precipitar después de suspender el Bacteriófago con 10 mlpbs, añadir 2,5 ml de solución de peg.8. Incubar sobre hielo durante 20 minutos y luegoCon función de control de baja temperaturaCentrifugadora ohouse 5816rCentrifugación de 4 ℃ 10000g durante media hora.9. Eliminar el sobrenadante, secar la solución residual de Peg con papel absorbente de agua, añadir 1 - 2 ml de Bacteriófago de suspensión PBS para la determinación del título.

Determinación del título:
1. En un laboratorio separado, se toma E. coli tg1 normal y se añade al medio de cultivo de 2xyt.usarSacudidora de ohouseSacudida a un valor de 0,5 od600Si no se utiliza a tiempo, se puede poner a 4 ° C durante 2 horas para repuesto.
2.Diluir 1e5 - 1e7 veces la solución original del Bacteriófago amplificado en el paso 9 con pbs.
3. Tomar una dilución de Bacteriófago de 10 ul y añadirla a E. coli tg1 con 490ul od600 de 0,5,usarSacudidora de ohouse 37 ° C 220 RPM oscilan durante media horaInfectarse.
4. Tomar el líquido infectado 50ul y aplicarlo uniformemente en una placa de agar que contiene 2xyt - ga, secarlo y ponerlo en una incubadora a 37 ° C durante la noche. Y se aplicó una placa de Agar a E. coli tg1 no infectada como control negativo.

Día 3
(el tercer día de mover ladrillos calvos)

5. Número de clones en la placa de Agar del número 2xyt - ga, el título del Bacteriófago amplificado se calcula en función del múltiplo de dilución
Título del Bacteriófago (pfu / ml) = (número de clones * 10 * 50 / 10 ul) * múltiplo de dilución
6.Tomar el Bacteriófago 1e11 - 1e12 para la búsqueda.

Fórmula del reactivo:
Medio 2xyt:Extracto de levadura 10,0 g/L + triptona 16,0 g/L + NaCl 5,0 g/L
Medio 2xyt - ga:Medio 2xyt + 100 μg / ML * + 1% (w / v) glucosa
Medio de cultivo 2xyt - ak:Medio de cultivo 2xyt + 100 μg / ML * + 50 μg / ML * *
PEG溶液：20% (p/v) PEG 6000, NaCl 2,5 M

Parte 5
Instrumento *:

(cada día como trabajador migrante de investigación científica no está solo, porque está acompañado por Xiao ao)

Como virus, los bacteriófagos se propagan fácilmente en forma de aerosoles al aire para contaminar el medio ambiente del laboratorio, necesitan laboratorios cerrados y todos los instrumentos del laboratorio deben usarse por separado.
OhousseSacudidora de cultivo de carga ligera a temperatura constanteEl rango de velocidad es de 100 - 12 - rpm, el volumen es intensivo y la función es poderosa, lo que puede proporcionar un excelente efecto de balanceo para sus muestras:

Además, el experimento de exhibición de bacteriófagos tendrá diferentes volúmenes, diferentes velocidades de rotación y pasos de centrifugación que requieren condiciones de 4 ° c, siamucho
Centrifugadora de MesaSatisfacer las necesidades de los experimentos¡¡ causará la vacante de activos de equipos experimentales y causará el desperdicio de *!¡!¡!

OhousseCentrifugadora multifuncional 5816r¡¡ y el rotor opcional facilitan los experimentos relacionados con los bacteriófagos, y una centrifugadora satisface todas las necesidades experimentales!

A continuación, Xiao ao te llevará.
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