Uso común

El fotómetro es una clase de instrumentos analíticos muy importantes, ya sea en física, química, biología, medicina, Ciencias de los materiales, ciencias ambientales y otros campos de investigación científica, o en los departamentos modernos de producción y gestión, como la industria química, la medicina, las pruebas ambientales y la metalurgia, El fotómetro visible ultravioleta tiene una amplia e importante aplicación. El espectrómetro es un instrumento que utiliza el método fotométrico para realizar análisis cuantitativos y cualitativos de sustancias, comúnmente utilizado en la cuantificación de ácidos nucleicos, proteínas y concentraciones de crecimiento bacteriano.

El espectrómetro ultramicro se ha convertido en un instrumento convencional en el laboratorio biológico Molecular moderno. Se utiliza comúnmente en la cuantificación de ácidos nucleicos, proteínas y concentraciones de crecimiento bacteriano.

Cuantificación de ácidos nucleicos

La cuantificación de ácidos nucleicos es una función de alta frecuencia de uso de espectrómetros ultramicro. Los oligonucleótidos que se pueden disolver cuantitativamente en el amortiguador, el ADN de una sola cadena, doble cadena y el arn. La longitud de onda de absorción del pico de alta absorción del ácido nucleico es de 260 nm. la composición molecular de cada ácido nucleico es diferente, por lo que su coeficiente de conversión es diferente. Para cuantificar diferentes tipos de ácidos nucleicos, se debe seleccionar previamente el coeficiente correspondiente. Por ejemplo: el valor de absorción de 1od es equivalente a 50 μg / ml de dsdna, 37 μg / ml de ssdna, 40 μg / ml de arn, 30 μg / ml de olig, respectivamente. El valor de absorción de luz después de la prueba se convierte por los coeficientes anteriores, obteniendo así la concentración de la muestra correspondiente. Antes de la prueba, seleccione el procedimiento correcto, introduzca el volumen del líquido original y la dilución, y luego pruebe el líquido en blanco y el líquido de muestra. Sin embargo, el experimento no fue fácil. La lectura inestable puede ser un dolor de cabeza para el experimentador. Cuanto mayor sea la sensibilidad del instrumento, mayor será la deriva del valor de absorción de luz mostrado.

De hecho, el principio de diseño y el principio de funcionamiento del espectrómetro permiten que el valor de absorción de luz cambie dentro de un cierto rango, es decir, el instrumento tiene cierta precisión y precisión. Por ejemplo, la precisión del espectrómetro ultramicro Colibri de berger, Alemania ≤ 1,0% (1a). Es normal que los resultados de tantas pruebas cambien entre un promedio de alrededor del 1,0%. Además, hay que tener en cuenta las propiedades físicas y químicas del ácido nucleico en sí y el pH del amortiguador que disuelve el ácido nucleico, la concentración de iones, etc. en el momento de la prueba, la concentración de iones es demasiado alta, lo que también conduce a la deriva de la lectura, por lo que se recomienda utilizar un amortiguador con un cierto pH y una concentración de iones más baja, como el te, que puede estabilizar considerablemente la lectura. La concentración de dilución de la muestra también es un factor que no se puede ignorar: debido a la inevitable presencia de algunas partículas finas en la muestra, especialmente muestras de ácido nucleico. La presencia de estas pequeñas partículas interfiere con el efecto de la prueba. Para reducir en gran medida el impacto de las partículas en los resultados de la prueba, se requiere que el valor de absorción de luz del ácido nucleico sea al menos superior a 0,1a, y el valor de absorción de luz es bueno en 0,1 - 1,5a. dentro de este rango, la interferencia de las partículas es relativamente pequeña y el resultado es estable. Esto significa que la concentración de la muestra no puede ser demasiado baja o demasiado alta (más allá del rango de prueba del fotómetro). Factores operativos, como la mezcla debe ser suficiente, de lo contrario el valor de absorción de luz es demasiado bajo, o incluso hay valores negativos; La mezcla no puede tener burbujas, el líquido en blanco no tiene suspensión, de lo contrario la lectura se deriva violentamente; Se debe utilizar la misma taza colorimétrica para probar el líquido en blanco y la muestra, de lo contrario la diferencia de concentración es demasiado grande; El coeficiente de conversión y la selección de la unidad de concentración de la muestra son consistentes; No se pueden usar tazas colorimétricas con ventanas desgastadas; El volumen de la muestra debe cumplir con el pequeño volumen requerido por la taza de comparación de color y otras operaciones.

Además de la concentración de ácidos nucleicos, El fotómetro muestra al mismo tiempo varias proporciones muy importantes que indican la pureza de la muestra, como la relación a260 / a280, que se utiliza para evaluar la pureza de la muestra, ya que el pico de absorción de la proteína es de 280 nm. en muestras puras, la relación es superior a 1,8 (adn) o 2,0 (arn). Si la relación es inferior a 1,8 o 2,0, significa que hay efectos de proteínas o fenoles. A230 indica la presencia de algunos contaminantes en la muestra, como carbohidratos, polipéptidos, * etc., y la relación entre el ácido nucleico más puro a260 / a230 es superior a 2,0. El A320 detecta la turbidez de la solución y otros factores de interferencia. Muestra pura, A320 es generalmente 0.

Cuantificación directa de proteínas

Este método consiste en probar la proteína directamente a una longitud de onda de 280 nm. Al seleccionar la fórmula warburg, El fotómetro puede mostrar directamente la concentración de la muestra o seleccionar el método de conversión correspondiente para convertir el valor de absorción de luz en la concentración de la muestra. El proceso de determinación de proteínas es muy simple, primero se prueba el líquido en blanco y luego se prueba directamente la proteína. Debido a la presencia de algunas impurezas en el amortiguador, generalmente es necesario eliminar la información de "fondo" de 320nm y configurar esta función para "abrir". Al igual que el ácido nucleico de prueba, se requiere que el valor de absorción de luz del A280 sea al menos superior a 0,1a, con un rango lineal entre 1,0 y 1,5. Cuando se seleccionó la fórmula Warburg en el experimento para mostrar la concentración de la muestra, se encontró que la lectura "flotaba". Este es un fenómeno normal. De hecho, siempre que se observe que el rango de variación del valor de absorción de luz del A280 no supera el 1%, los resultados son muy estables. La razón de la deriva es que el valor de absorción de la fórmula Warburg se convierte en concentración, multiplicada por un cierto coeficiente, siempre que el valor de absorción cambie ligeramente, la concentración se amplificará, lo que parece que el resultado es muy inestable. El método de cuantificación directa de proteínas es adecuado para probar proteínas más puras y con componentes relativamente únicos. El método cuantitativo directo ultravioleta es más rápido y fácil de operar que el método colorimétrico; Pero es vulnerable a la interferencia de sustancias paralelas, como el adn; Además, la sensibilidad es baja y se requiere una mayor concentración de proteínas.

Cuantificación de proteínas por Colorimetría

Las proteínas suelen ser compuestos de varias proteínas, y la determinación colorimétrica se basa en la composición de las proteínas: los aminoácidos (como *, *) reaccionan con grupos coloristas adicionales o tintes para producir sustancias de color. La concentración de sustancias de color está directamente relacionada con el número de aminoácidos que reaccionan con las proteínas, reaccionando así a la concentración de proteínas.

Los métodos de comparación de color generalmente incluyen bca, bradford, Lowry y otros métodos.

Método lowry: basado en la respuesta temprana de biouret y mejorado. La proteína reacciona con cu2 y produce un reactivo Azul. Pero en comparación con biouret, el método Lowry es más sensible. La desventaja es la necesidad de agregar varios reactivos de reacción diferentes en orden; La reacción tarda más tiempo; Vulnerable a las sustancias no proteicas; Las proteínas que contienen sustancias como edta, tritonx - 100 y ammoniasulfate no son adecuadas para este método.

Método BCA (bicinchinineniacidassay): este es un método de prueba de proteínas más nuevo y sensible. La proteína a analizar reacciona con cu2 en una solución alcalina para producir cobre, que forma un complejo complejo complejo con bca, formando un compuesto morado con un pico de absorción en una longitud de onda de 562 nm. La relación lineal entre este compuesto y la concentración de proteínas *, el compuesto formado después de la reacción es muy estable. En comparación con el método lowry, la operación es simple y la sensibilidad es alta. Pero similar al método lowry, es vulnerable a la interferencia entre proteínas y detergentes.

Método bradford: el principio de este método es que la proteína se une a la reacción de coomas lianglan y produce un pico de absorción de compuestos de color de 595 nm. se caracteriza por una buena sensibilidad, el doble que los dos métodos de prueba Lowry y bca; La operación es más simple y más rápida; Solo se necesita un reactivo de reacción; El compuesto puede estabilizarse durante 1 hora para facilitar los resultados; Y es compatible con una serie de reductores que interfieren con las reacciones de lowry, BCA (como dtt, mercaptoetanol). Pero sigue siendo sensible a los descontaminantes. La principal desventaja es que diferentes estándares pueden hacer que los resultados de la misma muestra sean muy diferentes e incomparables.

¿Algunos investigadores que miden la colorimetría de contacto inicial pueden estar confundidos por los resultados inconsistentes de varios métodos colorimétricos, ¿ en qué método deben confiar? Debido a que los grupos que reaccionan de varios métodos y los grupos de color son diferentes, el uso simultáneo de varios métodos no es comparable a la concentración de la muestra obtenida de la misma muestra. Por ejemplo: Keller y otros probaron proteínas en la leche humana, y los resultados lowry, BCA midieron concentraciones significativamente más altas que bradford, con diferencias significativas. Incluso si se determina la misma muestra, la muestra estándar seleccionada por el mismo método colorimétrico es inconsistente, y la concentración después de la prueba es inconsistente. Por ejemplo, se prueba la proteína en el homogeneizado celular con lowry, con BSA como estándar, concentración de 1,34 mg / ml, y globulina a como estándar, concentración de 2,64 mg / ML. Por lo tanto, antes de elegir el método colorimétrico, se busca una proteína estándar con una composición química similar como estándar con referencia a la composición química de la muestra a probar. Además, el problema frecuente de la cuantificación de proteínas por colorimetría es que el valor de absorción de luz de la muestra es demasiado bajo, lo que resulta en una gran brecha entre la concentración de la muestra medida y la concentración real. El problema clave es que el color de la taza de comparación de color, un accesorio importante del fotómetro 1011 después de la reacción, tiene una cierta semivida, por lo que cada método de comparación de color enumera el tiempo de prueba de reacción, y todas las muestras (incluidas las muestras estándar) deben probarse dentro de este tiempo. El tiempo es demasiado largo, el valor de absorción de luz obtenido se reduce y el valor de concentración convertido se reduce. Además, la temperatura de reacción y el valor de pH de la solución son razones importantes que afectan el experimento. Además, es muy importante que se utilice el método de comparación de color de los plásticos. Evite usar vasos de comparación de color de cuarzo o vidrio, porque el color después de la reacción hará que el cuarzo o el vidrio se coloreen, lo que resulta en valores de absorción de luz inexactos de la muestra.

OD600

El laboratorio determina la densidad de crecimiento y el crecimiento de las bacterias, y la densidad de crecimiento de las bacterias se deduce principalmente de la experiencia y la observación visual. En los experimentos que requieren mayores requisitos, es necesario utilizar un espectrómetro para determinar con precisión la densidad celular bacteriana. El od600 es el método estándar para rastrear el crecimiento microbiano en cultivos líquidos. El medio de cultivo sin líquido bacteriano se utiliza como líquido en blanco, y luego el medio de cultivo bacteriano después del cultivo cuantitativo. Para garantizar el correcto funcionamiento, es necesario contar las células con un microscopio para cada microorganismo y cada instrumento y hacer una curva de corrección. En el experimento, ocasionalmente, el valor de od del líquido bacteriano es negativo debido al uso de un medio de cultivo de color, es decir, después de un período de cultivo bacteriano, reacciona con el medio de cultivo y se produce una reacción de decoloración. Además, hay que tener en cuenta que las muestras probadas no pueden ser centrifugadas y mantener la suspensión bacteriana.